产品货号:
WH0056
中文名称:
DNA/RNA/蛋白共提试剂盒
英文名称:
DNA/RNA/Protein Isolation Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒可从培养的动物细胞或者组织中快速同步提取DNA、总RNA和总蛋白,可同时处理大量不同样品。1小时左右可完成反应。可用于PCR、RT-PCR和蛋白检测等多种分子生物学下游实验。
试剂盒特点:
试剂盒组成:
储存条件:室温保存一年,加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月。
选配试剂:DNaseI (目录号:WH0051)
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇
预防RNase污染,应注意以下几方面:
使用前注意事项:
操作步骤:
一、从培养细胞中同时提取DNA和总RNA
A.总RNA提取:
B.基因组DNA提取:
C.蛋白质提取流程见说明最下方。
二、从动物组织中同步提取DNA和总RNA
A.总RNA提取:
B.基因组DNA提取:
DNase I消化流程(可选):
DNase I储存液的配制:将DNase I干粉(1500U)溶解在550μL RNase-Free ddH2O中,轻柔混匀,分装后-20℃贮存(可保存9个月)。
注意:从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃(可保存6周),不要再次冻存。
蛋白质提取:
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试剂盒特点:
- 方便:从同一样本中同时得到DNA、RNA和总蛋白。
- 快速:1h左右可完成一次抽提。
- 安全:提取过程无需酚氯仿有机物。
- 可靠:可用于下游实验。
试剂盒组成:
组分 | 规格 |
裂解液RL | 30mL |
去蛋白液RW1 | 40mL |
漂洗液RW | 12mL |
RNase-Free ddH2O | 15mL |
RNase-Free吸附柱CR3(含2mL收集管) | 50套 |
吸附柱CB3 | 50个 |
缓冲液GD | 13mL |
漂洗液PW | 15mL |
洗脱缓冲液TB | 15mL |
RNase-Free离心管(1.5mL) | 100个 |
RNase-Free离心管(2mL) | 50个 |
RNase-Free收集管(2mL) | 50个 |
蛋白沉淀剂PR | 220mL |
蛋白溶解缓冲液SP | 15mL |
储存条件:室温保存一年,加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月。
选配试剂:DNaseI (目录号:WH0051)
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇
预防RNase污染,应注意以下几方面:
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
- 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
- RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
- 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(V/V),放置过夜,高压灭菌。)
使用前注意事项:
- 操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%,如1mL RL中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月,裂解液RL在储存时可能会形成沉淀,如果有沉淀出现,请加热至56℃溶解并平衡至室温后使用。
- 第一次使用前应在漂洗液RW、PW和缓冲液GD中加入无水乙醇,加入量请参见瓶上标签。
- 以下操作如非指明,均在室温下进行。
- 对于某些敏感的RNA应用实验可能需要完全去除DNA,可以参照DNase I消化流程在柱上进行。
操作步骤:
一、从培养细胞中同时提取DNA和总RNA
- 收集细胞:
悬浮细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1×107):估计细胞数量,300g离心5min,将细胞收集到离心管中,仔细吸除所有培养基上清。
单层贴壁细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1×107):可直接在培养容器中裂解(容器直径不超过10cm),或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。)- 直接裂解法:确定细胞数量,彻底吸除细胞培养基上清,立即进行第2步裂解步骤。
- 胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用PBS洗涤细胞,吸除PBS,向细胞中加入含有0.10~0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至1.5mL RNase-Free的离心管中,300g离心5min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清。
注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,影响RNA与吸附柱的结合,造成RNA的产量降低。 - 直接裂解法:确定细胞数量,彻底吸除细胞培养基上清,立即进行第2步裂解步骤。
- 裂解处理:
对于离心得到的细胞沉淀:轻弹离心管底部,使细胞沉淀松散,加入适量裂解液RL(见下表,使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),旋涡震荡30sec。沉淀细胞数量 裂解液RL <5×106 350μL 5×106~1×107 600μL
对于直接裂解的细胞:RL(见下表,使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),将细胞裂解液转移至离心管中,涡旋震荡30sec。容器直径 裂解液RL <6cm 350μL 6~10cm 600μL - 将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3 (吸附柱CB3放在2mL RNase-Free离心管中),12000rpm (~13400×g)离心30~60sec,收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。
A.总RNA提取:
- 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350μL或600μL),混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中(RNase-Free吸附柱CR3放入离心管(此管自备)中),12000rpm(~13400g)离心30~60sec,保留离心管中的液体(用于沉淀蛋白),将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
注意:配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O,如果滤液体积有所损失,请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时,如果体积大于吸附柱容量,可以分两次完成。 - 向RNase-Free吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
- 向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2min,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
- 重复步骤6。
- 12000rpm(~13400g)离心2min,倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验。 - 将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中,加入100μL RNase-Free ddH2O室温放置2min,12000rpm(~13400g)离心2min,得到RNA溶液。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于30μL,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。
B.基因组DNA提取:
- 向DNA吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入乙醇),12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
- 向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2min,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
- 重复步骤11。
- 12000rpm(~13400g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验。 - 将吸附柱CB3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中,加入100μL洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12000rpm(~13400g)离心2min,得到DNA溶液。
C.蛋白质提取流程见说明最下方。
二、从动物组织中同步提取DNA和总RNA
- 匀浆处理:
切割小块组织加入适量裂解液RL(见下表,使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),用电动或玻璃匀浆器将组织彻底研磨。旋涡震荡30sec。起始组织量 裂解液RL 10~20mg 350μL ≥ 20mg 600μL - 12000rpm(~13400g)离心3~5min,小心吸取上清至DNA吸附柱CB3 (吸附柱CB3放在2mL RNase-Free离心管中),12000rpm(~13400g)离心30~60sec,收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。
A.总RNA提取:
- 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350μL或600μL),混匀(此时可能会出现沉淀)。
注意:配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O,如果滤液体积有所损失,请相应减少70%乙醇用量。 - 得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中(RNase-Free吸附柱CR3放入2mL RNase-Free离心管中),12000rpm(~13400g)离心30~60sec,保留离心管中的液体(用于沉淀蛋白),将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
注意:将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时,如果体积大于吸附柱容量,可以分两次完成。 - 向RNase-Free吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
- 向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2min,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
- 重复步骤6。
- 12000rpm(~13400g)离心2min,倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验。 - 将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中,加入100μL RNase-Free ddH2O室温放置2min,12000rpm(~13400g)离心2min,得到RNA溶液。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于30μL,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。
B.基因组DNA提取:
- 向DNA吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入乙醇),12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
- 向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2min,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
- 重复步骤11。
- 12000rpm(~13400g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验。 - 将吸附柱CB3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中,加入100μL洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12000rpm(~13400g)离心2min,得到DNA溶液。
DNase I消化流程(可选):
DNase I储存液的配制:将DNase I干粉(1500U)溶解在550μL RNase-Free ddH2O中,轻柔混匀,分装后-20℃贮存(可保存9个月)。
注意:从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃(可保存6周),不要再次冻存。
- 按照总RNA提取流程1-4步进行提取。
- 向RNase-Free吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
- DNase I工作液的配制:取10μL DNase I储存液放入新的1.5mL RNase-Free离心管中,加入70μL RDD溶液,轻柔混匀。
- 向RNase-Free吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液,室温放置15min。
- 向RNase-Free吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,12000rpm(~13400g)离心30~60sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
- 按照RNA提取流程6~9步进行提取。
蛋白质提取:
- 将提取完RNA的流出液中加入四倍体积的冷丙酮(客户自备)或蛋白沉淀剂PR,充分混匀,冰上或-20℃放置10~30min。(请根据体积选择相应的离心管,离心管客户自备)。
注意:丙酮沉淀后的蛋白比PR沉淀的蛋白难溶解,但是沉淀的蛋白量较多,可根据试验的需要来选择。 - 12000rpm,4℃,离心10min,弃上清。
- 加入100μL冰冷的95%乙醇于沉淀中,4℃,最大转速离心1min,用移液器吸出上清,尽可能去除上清。
- 室温干燥沉淀。
注意:干燥不彻底也许会由于乙醇的残留导致蛋白上样出现问题,过分干燥会使蛋白沉淀比较难溶。 - 加入100μL或适量的蛋白溶解缓冲液SP(采用缓冲液SP溶解之后的蛋白样品适用于SDSPAGE及Westernblot试验,但不适合采用Bradford方法进行蛋白定量,如需采用Bradford方法进行蛋白定量可采用5%SDS溶解蛋白,亦可根据下游的试验选择适合的蛋白溶解缓冲液),加入的蛋白缓冲液的体积根据初始样本量及下游试验要求来确定。
蛋白样品如需进行SDS-PAGE电泳可进行如下操作: - 样品中加入蛋白loading buffer,95℃变性5~10min,然后冷却样品至室温。
- 最大转速离心1min,沉淀残余的未溶解物质,吸取上清进行下游的试验如SDS-PAGE和Western Blot等。溶解的蛋白可以-20℃保存数月或者4℃数天。
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